Producción de la maquinaria de fusión de membranas del Virus Zika en E. Coli para el testeo de una variante estabilizadora

Abstract

El virus Zika es transmitido a humanos por mosquitos del género Aedes aegypti y, desde su irrupción epidémica en el siglo XXI, representa un problema sanitario complejo en países tropicales. La proteína de envoltura E recubre la superficie viral y cumple un rol clave tanto en el ciclo de replicación como en la respuesta inmunitaria. Esta glicoproteína media la entrada viral por fusión de membranas y constituye el principal antígeno reconocido por el sistema inmune, lo que la convierte en un blanco estratégico para el diseño de tratamientos y métodos diagnósticos. En la partícula viral, E se organiza en 180 copias dispuestas como dímeros en simetría icosaédrica. Sin embargo, aislar esta conformación resulta desafiante debido a su tendencia a adoptar estados monoméricos o triméricos con distinta morfología y estabilidad. En este trabajo se diseña una variante estabilizada de E mediante mutagénesis sitio-dirigida in silico, incorporando pares de cisteínas orientados a formar puentes disulfuro en la interfase dimérica. Los modelos generados se validan estructuralmente mediante inteligencia artificial (AlphaFold3) y alineamientos tridimensionales. Las secuencias optimizadas se sintetizan y clonan en plásmidos de expresión pET21a(+), y se transforman en cepas competentes de E. coli preparadas en el laboratorio. Se evalúan diferentes condiciones experimentales, incluyendo dos cepas de expresión (E. coli BL21 y C41), dos medios de cultivo (LB y 2YT) y regímenes de inducción variables. El sistema más eficiente resulta ser la cepa C41(DE3) en medio 2YT con inducción a 37 °C, que permite una expresión robusta de la proteína. Asimismo, se implementa un protocolo de purificación con replegado oxidativo, logrando establecer un esquema de producción de bajo costo para una proteína estructuralmente compleja. En conjunto, este trabajo desarrolla y optimiza una plataforma bacteriana económica y escalable para la producción de proteínas de interés biomédico con estructuras cuaternarias estabilizadas, con potencial aplicación en estudios estructurales y en el desarrollo de candidatos vacunales.