Formulaciones mejoradas de proteasas virales para su uso en la obtención de proteínas recombinantes

Abstract

En los procesos de obtención de proteínas recombinantes pueden surgir diferentes problemas, como la obtención de producto mal plegado, sin actividad biológica o en cantidades insuficientes debido a su toxicidad para el organismo productor. Con el objetivo de mejorar el rendimiento en la producción de proteínas recombinantes, se diseñaron distintas estrategias, una de ellas es la obtención de una proteína de fusión o quimera. En este enfoque, se obtiene la proteína de interés unida mediante un conector o “linker” al extremo de otra proteína con propiedades beneficiosas que mitigan problemas como el mal plegado, baja solubilidad, toxicidad o simplificar su purificación. Una de las desventajas de esta estrategia es que puede, según el uso del producto proteico, requerir un paso adicional para separar la proteína de interés de la otra proteína a través de la digestión con una proteasa. Esto se logra mediante la inclusión de una secuencia de corte (secuencia de aminoácidos) para una proteasa específica en el conector o linker. La proteasa a utilizar debe ser específica (cortar solo en un único sitio), resistente a distintas condiciones de entorno y poseer una alta actividad enzimática, todas características que cumple la proteasa del Virus del Grabado del Tabaco conocida como TEVp (Tobacco Etch Virus protease). El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar un proceso productivo para la proteasa TEV y el mejoramiento de su actividad enzimática frente a sustratos complejos mediante el uso de diferentes excipientes. Con este objetivo utilizamos la bacteria E.coli BL21, cultivada en medio LB (Luria-Bertani) con ampicilina (100 μg/mL) como antibiótico de selección. La expresión se indujo con IPTG 0,4 mM y la purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad IMAC, seguida de una columna preparativa de exclusión molecular S-200, utilizando el equipo ÄKTA system. Como sustrato complejo se utilizó un constructo de MBP-CCNA2(Δ171) en E.coli C41, cultivado en medio LB con ampicilina (100 μg/mL). La inducción se realizó con IPTG 0,4 mM y la purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad por columna de amilosa y luego utilizando la misma columna de exclusión molecular, de la cual se recolectó la fracción oligomerizada. Entre los excipientes probados, ninguno mejoró la actividad enzimática significativamente frente a sustratos complejos, aunque la mayoría no afectó significativamente la actividad de la proteasa. Por lo tanto, estos excipientes podrían ser útiles para mejorar la solubilidad y estabilidad del producto en casos en los que este sea inestable luego del corte.